A debreceni múzeumi gondolat összefonódik az 1538-tól protestáns szellemben működő Kollégium oktatásának színvonalával és diákjainak külföldjárásával. A legtehetségesebb tanulók a peregrinációjuk eredményeként a kezdetektől gyarapították az iskola könyvgyűjteményét és a szemléltető oktatás eszközeit egyaránt.
Arany János egykori tanára, Sárvári Pál választotta ki a könyvtárból azokat a tárgyakat, amelyeket 1812-ben a „physicai museum”-ban helyezett el. Tőle származik az első tárgylista (1840) – amely leginkább a naturáliák és a ritkaságok gyűjtéséről tanúskodik –, sőt a következő esztendőben már kisebb néprajzi gyűjteményről is tudunk. Másfél évtized alatt az iskola gyarapodása olyan számottevő, hogy Kovács János (az első képzett magyar természettudós, aki eljutott Afrikába) 1858-ban megnyitotta az épületben a város első állandó múzeumi kiállítását. 1876-tól a kollekciót négy helyiségben összesen 283 négyzetméteren mutatják be. Az ő nyugalomba vonulásával megszűnt a kiállítás, 1916-tól pedig már csak Zoltai Lajos, a Kollégium egykori diákja szorgalmazta a folytatást.
A két világháború között Csikesz Sándor kollégiumi professzor felvetette egy debreceni székhelyű Országos Református Múzeum gondolatát. Terve nem valósulhatott meg, de az általa kezdeményezett első Országos Református Kiállítás (1934) hatalmas sikerrel járt. A kiállítás fotó- és műtárgy anyagának értékes darabjai kerültek a Kollégium gyűjteményébe. A múzeum ügye az egyház anyagi és egyéb nehézségei miatt azonban évtizedekre háttérbe szorult. A megújulást biztosító miniszteri rendelet csak 1964-ben tette lehetővé, hogy Módis László tervei és Takács Béla fáradhatatlan gyűjtése folytán 1968-ban ismét állandó kiállítás nyíljon.
A régi tárlatok az utóbbi évtizedben tartalmilag és technikailag egyaránt megújultak. Az iskolatörténeti kiállítás 1996-ban és 2017-ben kapott új formát, kiegészült a Fazekas Mihály Emlékszobával és néhány, a Kollégium irodalmi múltjához kapcsolódó tárgyi emlékkel. Az egyházművészeti tárlat 2001-ben és 2016-ban, a Csokonai-szoba pedig 2012 és 2015 között többször is átalakult. 2017-ben külső kiállítási helyszínen, a Debreceni Református Kollégium Dóczy Gimnáziumában nyitotta meg kapuit a múzeum filiáléjaként a Szabó Magda Emlékház.
